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如何快速地完成荧光Western Blot?

发布时间:2021-08-30 14:53 |  点击次数:

  随着荧光检测的普及,许多科研人员将western blot的检测方法从化学发光转到多重荧光。这是因为荧光检测能够实现多重western blot分析,每次能够同时检测几个目标蛋白,而不再需要剥离和重新杂交。另外,荧光的好处在于动态范围更宽、信号稳定性更好。为了让你的实验过程能轻松+成功,小编带来了一些荧光western blot的小贴士!

  荧光Western Blot基础知识

  荧光western blot可以进行多重检测并生成可定量的精准数据满足期刊杂志对于数据发表的要求。荧光检测解决了化学发光检测所面临的一些局限性,例如:数据的重现性,半定量,动态范围等问题。所以荧光Western blot变得越来越流行。对于需要更复杂的信号线性分析和蛋白丰度相关性的研究人员来说,荧光方法是一个很好的选择。

  一旦你决定使用荧光数字成像系统,下一步就是仔细考虑印迹试剂了。高品质,低荧光膜是荧光Western blotting的shou选。也需要优化封闭液和漂洗液,提供更好的解决方案。小伙伴在从化学发光转换到荧光检测时遇到的最大问题之一是高背景。使用正确的膜,以及封闭液和漂洗液,将确保你开始正确的荧光western实验。在转印过程中,关键是要使用一种不会产生太多热量的协议。高温会导致背景升高,特别是在可见荧光检测中。因此,在不产生过多热量的缓冲液中,短时间内进行湿转或半干转是理想的选择。

  最后和最具挑战性的试剂选择是荧光二抗的选择。幸运的是,随着荧光检测方法的日益普及,市场上有大量的商品化的荧光二抗可供选择。在选择抗体染料偶联物之前,了解成像系统每个通道的激发波长和发射波长是很重要的。一旦了解了这些信息,您就可以选择与您的系统最兼容的染料。

  如何提高荧光western blot检测效果

  用滴定法测定一抗和二抗的原始浓度。

  多重检测之前,先分别对目的蛋白和内参进行优化。

  一抗的使用浓度要高于传统的化学发光的2-5X。二抗的浓度也需要增加,一般建议使用的初始稀释度是1:5000。

  使用低背景的PVDF 膜。NC 膜和一些PVDF 自发荧光较高, 引起高背景。

  避免标记和染料本身产生的荧光。使用铅笔标记印迹膜。例如溴酚蓝和考马斯亮蓝都有自发荧光。

  保持洁净,在使用前对托盘等设备进行清洗,戴手套处理凝胶,用镊子处理膜。

  荧光抗体要避光保存,防止发生淬灭现象,影响抗体的使用。

  当进行多重检测的时候,染料要避免重叠,选择光谱距离较远的染料进行孵育。

  想要保存印迹膜,需要将其避光保存。