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延慕实验:WB 上样前如何制样?

发布时间:2021-08-26 11:13 |  点击次数:

WB 是实验室常见实验之一,蛋白定量后,上样之前,还需要哪些步骤制样呢?


1. 蛋白含量测定后,延慕 建议大家把各个样品稀释到某一固定浓度(稀释可使用 PBS,水或裂解液),等体积等质量上样,计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积。

例如:把所有蛋白浓度都稀释到 2ug/ul,然后与 2Xloading buffer 1:1 混合后,浓度成为 1ug/ul,建议上样 20-30ul 即可。

2. 与 loading buffer 混匀后,要将样品在沸水中煮 3-5 分钟,使蛋白充分变性。也可使用 PCR 仪 95°加热 5 分钟。

PS:煮沸并非必须步骤,有些蛋白仅需 70℃ 煮或无需煮沸,具体请参照抗体要求操作。

3. 煮沸后在冰上静置少许时间后进行低速离心,即可上样。剩余样品建议分装后保存,样品可以在 4℃ 冰箱短时间保存,也可以在-20 或-80℃ 保存,解冻后可重新煮沸上样。

SDS-聚丙-烯酰胺凝胶电泳中样品为什么要加 loading buffer?

loading buffer 的功能,第一,含有指示剂溴酚蓝和二甲-苯氰 FF 起到指示的作用,显示电泳的进程,以便我们适时终止电泳;第二,成分中的甘油可以加大样品密度,使样品密度大于 Tris   或者其他缓冲液,从而沉降到点样孔中,防止样品飘出点样孔;第三,loading buffer 中 SDS 是比较强的阴离子表面活性剂,与蛋白质表面结合,覆盖蛋白质本身的电荷性质,使之表面带负电荷。SDS 还可以破坏维持蛋白质高级结构的重要因素--疏水键,使蛋白质解构。2-ME 和 DTT 是比较强的还原剂,可以打开蛋白质分子内和分子间的二硫键, 使蛋白质亚基分离。

上样之前煮沸的目的是什么?

煮沸样品的目的是为了更好地将蛋白质的高级结构打开。在温度高时,一方面维持蛋白质高级结构的各种作用力减弱,另一方面促进 SDS 的电荷覆盖和疏水键打开作用。通过上样 buffer 和加热的处理,蛋白样品呈现带负电荷的长链(还原电泳),在电泳时的分子筛效应使得泳动只和蛋白质大小有关(也就是表观分子量),与蛋白形状无关。