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动物组织中DNA的制备实验方法

发布时间:2021-08-24 11:13 |  点击次数:

(一)原 理
DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。
细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合,形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后,这两种核蛋白将混杂在一起。因此,要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度,如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大,脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小(仅约为在纯水中的1%);而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度增大,至少是在纯水中的2倍,核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性,调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此,在细胞破碎后,用稀盐溶液,反复清洗,所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。

分离得到的脱氧核糖核蛋白,用十二烷基硫酸钠(SDS)使蛋白质成分变性,让DNA游离出来,再用含有yi戊醇的氯-仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点,加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来,获得产品。

当细胞破碎时,细胞内的脱氧核糖核酸酶(DNase)立即开始降解DNA,如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施,最后将会得不到任何DNA。为此,如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2+离子,使DNase活性降低,并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行,以减少DNase的降解作用,最后加入SDS使所有的蛋白质(包括DNase)变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时,则在细胞破碎后,及时加入SDS使蛋白质(包括DNase)变性,并加入蛋白酶K,降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸,及时阻止DNase的降解作用。

DNA分子很大、很长,在水中呈黏稠状,但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠,使之DNA分子具有刚性,即分子是僵直的(stiff),小角度的折叠和压挤等剪切力,将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA,操作时应避免急裂振摇,或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头,不可猛吸猛放,更不能用细的吸头反复吹吸。

大分子DNA的水溶液呈黏稠状,可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存;抽干后的固体DNA,性质稳定,可长期保存。
生物体内各部位的DNA是相同的,但取材时以含量丰富的部位为主,如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料,必须新鲜及时使用,或放入-20℃冰箱或液氮冷冻保存。
DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。

(二)试剂及器材
(1) 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液:称取8.77g NaCl,4.41g柠檬酸三钠(Na3C6H507 · 2H20),用约800ml蒸馏水溶解后,调节pH至7.0,最后定容至1 000ml。
(2) 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液:称取8.77g NaCl,37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中,以NaOH调pH至8.0,最后定容至1 000ml。
(3) 5%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液:称取5g SDS溶于45%(V/V)100ml的乙醇中。
(4) 氯-仿– yi戊醇溶液:按氯-仿:yi戊醇=24:1配制。
(5) pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/LNaOH:120mol/L Tris–HCl,lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。
(6) 95%(V/V)乙醇1 000ml。
(7) 75%(V/V)乙醇1 000ml。
(8) 组织捣碎机。
(9) 玻璃匀浆器。
(10) 冷冻离心机。
(11) 冰、粗盐。

(三)操作
(1) 本实验以兔肝脏作材料(其他动物肝脏也可以)。实验前应将兔饥饿24h以上,以避免糖原的干扰。
(2) 用烧杯(500m1)放1/3体积的冰,加入少量水及约20g食盐,制成冰盐水。
(3) 将经过饥饿的兔颈部放血致死,迅速开腹取出肝脏,称取约10g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物;再用少量溶液反复洗涤几次,直至组织块无血为止。
(4) 将洗净的组织剪成碎块。先加入20m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液,放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆,再放入玻璃匀浆器中匀浆2~3次,使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol–L柠檬酸钠溶液至50ml。
(5) 匀浆液在4℃ 6 000r/min离心15min,弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L柠檬酸钠溶液,搅匀,按上述条件,离心弃上清。如此重复操作2~3次,尽量洗去可溶的部分(目的是什么?)。最后弃去上清,留沉淀。
(6) 将沉淀物(约5m1)悬浮于5倍体积的pH8.0,0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2溶液中,搅匀,而后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液,直至SDS的最终浓度达1%为止(应加多少毫升?),此时溶液变得十分黏稠,若不黏稠应重做,然后,加入固体NaCl使最终浓度达l mol/L。继续搅拌30~45min,以确保NaCl全部溶解,此时可见溶液由稠变稀薄。
(7) 将上述混合溶液倒于一个300ml的带塞三角瓶中,加入等体积的氯-仿– yi戊醇,振荡10min。在室温3 000r/min离心10min(为什么可以在室温操作?),此时可见离心液分为3层:上层为水溶液,中层为变性蛋白块,下层为氯-仿– yi戊醇。小心吸取上层水相,记录体积,放入三角瓶中,向水相中,再加入等体积氯-仿– yi戊醇,振荡,离心,如此重复抽提2–3次,除净蛋白质。
(8) 最后1次离心后,小心吸取上层溶液(不要吸取下层氯-仿),记录体积,放入干燥小烧杯中,加入2倍体积预冷的95%乙醇。加时,用滴管吸取乙醇,边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动,随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质,并能逐步缠绕于玻璃棒上,此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上,直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。
(9) 将所得的DNA从玻璃棒上取下,用75%乙醇洗2次,置于干燥器中抽干,称取重量,计算产率。
(10) 按200μg/ml的浓度称取一定量DNA,溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE缓冲液中(干燥DNA不易溶解,应在测定前几天预先溶解)。